动物新型疫苗研究进展

近20年来，随着生物技术在兽医生物制品领域应用的不断深化和发展，疫苗制造技术和免疫学技术得到迅猛发展，产生了多种新型疫苗，包括基因重组亚单位疫苗、活载体基因工程疫苗、基因工程缺失疫苗和植物转基因工程疫苗等。此外，疫苗除应用于预防动物疫病外，新技术已将其扩展到治疗性疫苗、肿瘤疫苗和生理调控疫苗等。核酸疫苗、T细胞疫苗和树突状细胞疫苗彻底改变了疫苗多为蛋白、只能预防的经典概念，大大拓展了人们对疫苗组成和功能的认识，被称为疫苗学的第三次革命。虽然目前世界上已注册并正式投放市场的新型疫苗尚不多，但是，它们代表着疫苗研究的新途径，并为克服一些常规疫苗的缺陷带来希望，因此已越来越受到重视。

　　一、重组亚单位疫苗

　　基因工程重组亚单位疫苗是用DNA重组技术，将编码病原微生物保护性抗原的基因导入原核或真核细胞，使其在受体细胞中高效表达，分泌保护性抗原蛋白。提取保护性抗原蛋白，加入合适佐剂即制成基因工程重组亚单位疫苗。应用重组DNA技术研制重组亚单位疫苗，必须有合适的表达系统用于生产目的基因产物。用于该类疫苗生产的表达系统主要有原核生物、真菌、昆虫细胞和哺乳类细胞。其中，最常用的原核生物是大肠埃希氏菌(E.coli)和枯草杆菌(Bacillus subtilis)。该类疫苗的研制步骤为：(1)通过重组DNA技术将编码所需多肽(保护性抗原)的基因插入表达载体(质粒)；(2)将插入外源基因的重组表达质粒导入系统的宿主细胞；(3)鉴定和选择表达所需多肽的细胞，并作纯培养繁殖；(4)优化表达系统中基因表达和产物稳定性的调节和控制参数，实现所需基因产物的高水平表达。

　　兽用口蹄疫基因工程亚单位疫苗、预防仔猪和犊牛下痢的大肠杆菌菌毛基因工程重组亚单位疫苗已发挥一定作用

　　该类疫苗的优点是：(1)疫苗中只含有产生保护性免疫应答所必需的免疫原成分，不含传染性材料，安全性好。接种后不会发生急性、持续或潜伏感染，可用于不宜使用活疫苗的一些情况，如妊娠动物。将高度危险和致病的病原体的免疫原性蛋白质编码基因转移到不致病而且无害的微生物，用于大量生产，更增加了安全性。(2)疫苗中减少或消除了常规活疫苗或死疫苗难以避免的热原、变应原、免疫抑制原和其他有害的反应原，副作用小。(3)稳定性好，便于保存和运输。(4)可用于外来病病原体和不能培养的病原体，扩大了用疫苗控制疫病的范围。(5)产生的免疫应答可以与感染产生的免疫应答相区别，因此更适合于疫病的控制和消灭计划。其缺点是：(1)价格昂贵，虽然产品生产本身的费用不一定高，但产品研究和开发的费用通常都较高。(2)免疫原性通常比复制性完整病原体差，需要多次免疫才能得到有效保护。

　　目前，人类的乙型肝炎基因工程亚单位疫苗已被广泛应用。兽用口蹄疫基因工程亚单位疫苗、预防仔猪和犊牛下痢的大肠杆菌菌毛基因工程重组亚单位疫苗已发挥一定作用。炭疽保护性抗原(PA)、致死因子(LF)和水肿因子(EF)三联毒素亚单位疫苗、绵羊腐蹄病结拟杆菌柔毛亚单位疫苗、链球菌和牛布氏杆菌亚单位疫苗、疱疹病毒主要糖蛋白亚单位疫苗和生长抑素(14肽)亚单位疫苗已取得较好进展。 　　

　　二、重组活载体疫苗

　　基因工程重组活载体疫苗是用基因工程技术将病毒或细菌(常为疫苗弱毒株)构建成一个载体(或称外源基因携带者)，把外源基因(包括重组多肽、肽链抗原位点等)插入其中使之表达的活疫苗。该类疫苗免疫动物向宿主免疫系统提交免疫原性蛋白的方式与自然感染时的真实情况很接近，可诱导产生的免疫比较广泛，包括体液免疫和细胞免疫，甚至黏膜免疫，所以可以避免重组亚单位疫苗的很多缺点。如果载体中同时插入多个外源基因，就可以达到一针防多病的目的。简言之，病毒活载体疫苗兼有常规活疫苗和灭活疫苗的优点。它具有活疫苗的免疫效力高、成本低及灭活疫苗的安全性好等优点。是当今与未来疫苗研制与开发的主要方向之一。国外已研制出以腺病毒为载体的乙肝疫苗、以疱疹病毒为载体的新城疫疫苗等。当然，这类疫苗有时因机体对活载体的免疫反应性质，可限制再次免疫的效果。

　　目前，主要的病毒活载体有牛痘病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒、人2型和5型腺病毒、火鸡疱疹病毒、伪狂犬病病毒、水痘－带状疱疹病毒、微RNA病毒、黄病毒和脊髓灰质炎病毒等，主要的细菌活载体包括BCG、沙门氏菌、枯草杆菌、李斯特氏菌、大肠杆菌、乳酸杆菌、志贺氏菌。

(一)重组载体病毒活疫苗　病毒载体有两种：一种是复制缺陷性载体病毒，只有通过特定转化细胞的互补作用或通过辅助病毒叠加感染才能产生传染性后代，故无排毒的隐患，同时又可表达目的抗原，产生有效的免疫保护。如用金丝雀痘病毒为载体，表达新城疫病毒HF基因，用于预防鸡的新城疫。另一种是具有复制能力的病毒，如疱疹病毒、腺病毒和痘病毒都可作为外源基因的载体而保持其传染性。

　　有很多重组蛋白在该载体病毒中表达成功，攻毒保护效率良好

1、痘病毒载体：痘病毒是研究最早最成功的载体病毒之一，它具有宿主范围广、增殖滴度高、稳定性好、基因容量大及非必需区基因多的特点。因此，有利于进行基因工作操作，易于构建和分离重组病毒。它还可以插入多个外源基因，并对插入的外源基因有较高的表达水平。目前已有很多重组蛋白在该载体病毒中表达成功，攻毒保护效率良好。如HIV-1主要囊膜蛋白(gp120)重组痘病毒，已进入临床试验；应用鸡痘病毒载体国内外先后成功表达流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、马立克氏病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、狂犬病病毒、传染性支气管炎病毒、麻疹病毒、猿猴免疫缺陷病毒、艾美尔球虫等的保护性抗原基因，其中部分产品已正式注册。

　　有许多病毒的抗原基因用腺病毒载体表达成功，如伪狂犬病病毒gP50蛋白、狂犬病病毒G蛋白、HIV env/gag和gp160蛋白、轮状病毒VP4和VP7蛋白及鸡IBDV VP2蛋白等

2、腺病毒载体：腺病毒作为活载体也是目前研究热点之一。虽然腺病毒载体对外源基因的容量较小(20kb)，但它具有独特的优点：(1)腺病毒比较安全。(2)腺病毒的靶细胞范围广，不仅能感染复制分裂细胞，而且能感染非复制分裂细胞。(3)腺病毒容易制备，对热不敏感，在适合的培养系统中呈高滴度增殖。(4)腺病毒可以在肠道及呼吸道繁殖，能诱导黏膜免疫，能制成药囊经口服途径接种以预防消化道及呼吸道感染。(5)Ad2、Ad5等启动子较强，能高水平表达外源基因，特别是换以更强的启动子如CMV早期启动子后，更可明显提高外源基因的表达水平。目前已有许多病毒的抗原基因用腺病毒载体表达成功，如伪狂犬病病毒gP50蛋白、狂犬病病毒G蛋白、HIV env/gag和gp160蛋白、轮状病毒VP4和VP7蛋白及鸡IBDV VP2蛋白等。

　　活载体表达外源基因作为疫苗的研究主要有：单纯疱疹病毒、伪狂犬病毒、火鸡疱疹病毒等

3、疱疹病毒载体：随着疱疹病毒弱毒苗的问世及质量不断提高，以此为基础的活载体也逐渐成为研究目标。疱疹病毒的基因组较大，约150kb左右，可容纳多个外源基因的插入。大多数疱疹病毒(伪狂犬病毒除外)的宿主范围很窄，其重组病毒的使用不会产生流行病学方面的不良后果。许多疱疹病毒经粘膜途径感染，构建的载体活疫苗可经黏膜途径提呈抗原，诱导特异性黏膜免疫。目前，疱疹病毒作为活载体表达外源基因作为疫苗的研究主要有：单纯疱疹病毒、伪狂犬病毒、火鸡疱疹病毒、牛疱疹病毒I型、马疱疹病毒I型和传染性喉气管炎病毒等。其中，火鸡疱疹病毒活载体，是禽病毒基因工程研究中比较活跃的领域。新城疫病毒的F和HN基因重组马立克氏病毒疫苗、马立克氏病HVT/MDVgB重组疫苗、传染性法氏囊病病毒VP2基因重组HVT活载体疫苗取得很好研究进展。利用口蹄疫病毒、猪瘟病毒重组伪狂犬病病毒活载体疫苗、表达FMDV VP1基因及PRV的gⅢ基因的重组牛Ⅰ型疱疹病毒活载体疫苗研究也取得明显进展。

　　但是，用上述痘病毒、疱疹病毒和腺病毒作载体也带来一些问题，这些病毒对体内复制的复杂要求，毒力性质还不完美，宿主范围不如人意，都需进一步研究。例如腺病毒在淋巴组织和疱疹病毒在神经组织的持续感染，疫苗病毒感染的进行性过程等都是必须认真对待的问题。我们必须更好地了解这些载体病毒发生具体缺失突变的后果，如在插入外源基因时所引起的突变，它们可能影响毒力，亲嗜性宿主范围以及免疫原性。

4、小RNA病毒载体：近年来以RNA病毒为活载体的研究令人鼓舞，如已证明脊髓灰质炎病毒疫苗株在实际应用中安全，可口服。病毒容易增殖，感染滴度高。该载体表达的外源蛋白以嵌合形式存在于载体病毒颗粒表面，故免疫效果较理想，如HIVgP41重组脊髓灰质炎病毒可诱导兔产生中和抗体。

(二)重组载体细菌活疫苗　以疫苗株沙门氏菌、李斯特氏菌和卡介苗作为外源基因的载体已越来越引起研究者们的兴趣，并具有巨大的应用潜力，它除了具有病毒活载体的优点外，还具有培养方便，外源基因容纳量大，刺激细胞免疫力强等优点。细菌载体本身就起佐剂作用，刺激产生强的B细胞和T细胞免疫应答。口服沙门氏菌疫苗还能刺激黏膜免疫，且不像其他疫苗需要注射，因此用它作载体更具有吸引力。把外源基因插入合适的载体质粒，转化进细菌，或导入细菌染色体。以细菌为载体的疫苗比重组载体病毒活疫苗的研究难度更大，但近年来在构建多价疫苗方面已取得相当大的进展，如把志贺氏菌、霍乱弧菌和大肠埃希氏菌的抗原基因导入沙门氏菌表达，猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M蛋白重组结核分支杆菌疫苗等。