我国首例非洲猪瘟的确诊

我国首例非洲猪瘟的确诊

王清华 1，任炜杰 1，包静月 1，戈胜强 1，李金明 1，李林 1，樊晓旭 1，刘春菊 1，王华 1，永强 1，徐天刚 1，吴晓东 1，段亚良 2，顾贵波 2，周晨阳 2

（1. 中国动物卫生与流行病学中心，国家外来动物疫病研究中心，山东青岛 266032；2. 辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳 110164）

摘要：近日，辽宁省沈阳市一养猪户饲养的猪陆续发生不明原因死亡，病死猪剖检发现脾脏异常肿大，疑似非洲猪瘟病毒感染。经国家外来动物疫病研究中心检测，确诊为非洲猪瘟病毒核酸阳性，B646L/p72 基因序列417 个碱基与俄罗斯毒株 100% 匹配，与俄罗斯和东欧目前流行的格鲁吉亚毒株（Georgia 2007）属于同一进化分支。这是我国发现的首例非洲猪瘟，疫情来源有待进一步调查。关键词：非洲猪瘟；非洲猪瘟病毒；荧光定量 PCR ；普通 PCR ；ASFV 特异性抗体中图分类号：S852.65 文献标识码：A

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus， ASFV）引起猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征，易感猪群的病死率高达 100%。鉴于该病的严重危害性，世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。ASFV 不感染人，对人的健康不构成威胁。目前，针对 ASF 防控，尚无有效的商品化疫苗。

2018 年 8 月 1 日，国家外来动物疫病研究中心接到辽宁省沈阳市沈北区发现 ASF 临床可疑病例的报告（图 1）。截至 8 月 1 日，发病猪场累计死亡 47 头，对刚病死的 2 头猪剖检发现：脾脏极度肿大，严重梗死，质脆易碎，其中一头猪脾肿大至少 10 倍，一头猪脾肿大 5~7 倍；肺出血、质硬，有间质性肺炎变化；下颌淋巴结、肠系膜淋巴结出血，切面呈大理石样变；胃浆膜面弥漫性出血；肾肿胀明显、色淡，未见出血点；扁桃体见陈旧性出血，符合 ASF 症状。国家外来动物疫病研究中心立即开展病原学检测，证实本次疫情由ASFV 引起。这是我国历史上的首次 ASF 发病记录。

图 1 发病场地理位置

1 材料与方法

1.1 病料

病原学样品：分别来源于 2 头病死猪的剖检病料，包括全血、脾脏、淋巴结、扁桃体；30 头临床健康猪的全血。

血清样品：2 头病死猪及同群 30 头临床健康猪血清。

1.2 病料 DNA 提取

在加有陶珠的组织匀浆管（Roche）中，加入600 µL PBS 缓冲液，再加入剪碎的组织样品约 30mg，使用 HyBaid RiboLyser 组织匀浆机进行匀浆处理。取 200 µL 组织匀浆液和全血，分别使用病毒 DNA 提取试剂盒提取 DNA。最后将提取的核酸于 −80 ℃冰箱中保存备用。

1.3 荧光定量 PCR

依据文献报道 [1]，用本实验室建立的 OIE 推荐的 ASFV 特异的荧光定量 PCR 方法进行 ASFVp72 基因片段的扩增。ASFV特异性引物为 king-s/ king-a，TaqMan 探针为 ASFVP，同时以本试验室合成的质粒 DNA 标准品为阳性对照。

1.4 普通 PCR

依据文献报道 [2]，用本实验室建立的 OIE 推荐的 ASFV 特异的 PCR 方法进行 ASFV p72 基因片段的扩增。ASFV特异性引物为 PPA1/PPA2，产物长度为 257 bp，同时以本试验室合成的质粒DNA 标准品为阳性对照。

1.5 测序片段 PCR 扩增

依据文献报道 [3-4]，合成扩增 p72 基因分型的通用型引物（p72-D/p72-U）。引物由上海生工生物技术有限公司合成。采用高保真的Phusion High-Fidelity PCR Master Mix 扩增B646L/p72基因片段，预期扩增片段大小 478 bp。50 μL 的 PCR 反应体系为：2X Phusion Master Mix 25 µL，p72-D（10μmol/L）和 p72-U（10 μmol/L）各 2 µL，模板DNA 2 μL，用灭菌水补齐体积至 50 μL。PCR 反应程序为：98 ℃预变性 30 s；然后进行 35 个 PCR 循环（98 ℃ 10 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）；最后 72℃ 10 min。

1.6 PCR 产物测定

扩增产物使用 1% 的琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收，对回收的 DNA 直接用于测序。序列拼接采用 Lasergene 7.1 软件（DNASTAR Inc.Madison，WI，USA）中的 EditSeq 与 MegAlign模块。多序列的比对和遗传进化树的绘制，应用MEGA 5.0 软件进行。其他国家的参考毒株序列从GenBank 中获得。

1.7 抗体检测

西班牙 INGENASA 公司生产的非洲猪瘟阻断 ELISA 抗体检测试剂盒，批号为 050218。法国ID-vet 公司生产的非洲猪瘟间接 ELISA 抗体检测试剂盒，批号为 B71。国家外来动物疫病研究中心自主研发的非洲猪瘟间接 ELISA 试剂盒，批号为 201801。INGENASA 公司生产的非洲猪瘟阻断ELISA 试剂盒包被抗原为 p72 蛋白，IDvet 公司生产的非洲猪瘟间接ELISA 试剂盒包被抗原为p30、p62、p72 重组蛋白，自主研发的非洲猪瘟间接ELISA 试剂盒包被抗原为 p30 蛋白。

2 结果

2.1 荧光定量 PCR

荧光定量 PCR 检测结果显示，采自 2 只病死猪的 8 份组织样品和全血中都能检测到ASFV 特异性扩增曲线，Ct 值为 19.14~26.5（图 2）。

图 2 实时定量 PCR 扩增结果

扩增曲线的横坐标为扩增循环数，纵坐标为荧光强度；绿色横线位置为荧光强度的阈值，对应的循环数为临界循环数（CT）；CT 值低于 40 判定为阳性；图中扩增曲线从左至右依次为P、全血 1、脾 1、全血 2、淋巴结 2、肾 2、淋巴结 1、肾 1、脾 2

2.2普通 PCR

ASFV 普通PCR 扩增结果显示，7 个样本（分别为全血 1、淋巴结 1、肾 1、脾 1、全血 2、淋巴结 2、肾 2）在 257 bp 左右有特异性扩增条带，与阳性对照一致（图 3）。样本脾 2 特异性扩增条带较弱。

图 3 普通 PCR 检测结果

1~8. 全血 1、淋巴结 1、肾 1、脾 1、全血 2、淋巴结 2、肾 2、脾2；P. 阳性对照；N. 阴性对照；M. 分子量标记（由上至下分别为2000、1000、750、500、250、100 bp

2.3 p72 基因片段序列遗传进化分析

对样本 B646L/p72 基因片段普通 PCR 产物进行正反向测序，对得到的序列进行拼接后获得 p72基因片断序列，长度为 417 bp（图 4）。对扩增的P72 基因序列，应用邻接法（Neighbor-joining）绘制了遗传发生树（图 5）。结果显示，该样本病毒属于基因 II 型，与目前在俄罗斯和东欧流行的格鲁吉亚毒株（Georgia 2007）同属于一个进化分支。

2.4 抗体检测

对 32 份血清样品的 ASFV 特异性抗体检测结果均为阴性。

图 4 样本 p72 基因片段测序结果

图 5 P72 基因遗传进化分析

3 讨论

ASFV 是非洲猪瘟病毒科（Asfarviridae）非洲猪瘟病毒属的唯一成员，基因组为双股线状DNA，大小为 170~190 kb。根据病毒编码主要衣壳蛋白 p72 的 B646L 基因，可将该病分为 24 个与地域性相关的基因型 [5-6]。基因 II 型流行于非洲东南部，2007 年传至格鲁吉亚，并扩散到俄罗斯联邦和东欧地区 [7]，已在高加索地区定殖；2017 年，该基因型病毒向东长距离跨越式传播至俄罗斯远东地区伊尔库茨克 [9]，导致传入我国的风险空前升高。目前，ASF 已经成为困扰欧洲养猪业的一个重要问题 [8]。该病跨国界传播能力和危害性使其成为全球性的问题。

本次疫情是我国确诊的首例非洲猪瘟。该猪场生物安全条件较差，紧临车辆繁忙的乡间公路，场区出入口无消毒池。病死猪在当地兽医部门监督下就近掩埋处理，有相应的生猪保险理赔记录。剩余存栏生猪 336 头，临床未见异常。据了解，死亡猪多为100 kg 的大猪。p72 基因片段遗传进化分析显示，本次暴发流行的毒株为基因 II 型，与俄罗斯及东欧流行的毒株属同一分支，提示疫情可能来自俄罗斯和东欧疫情国家。为进一步确定病毒与俄罗斯和东欧流行株的差异，正在对全基因组序列进行分析。值得注意的是，该起疫情的病死率虽然很高（100%），但发病率和死亡率较低，发病高峰期 10头左右，平常日均死亡 3 头左右。此外，同群猪临床健康，随机采集 30 头猪的抗凝血、血清样品的病原学检测结果和血清学检测结果均为阴性，提示该起疫情毒株的群内传播能力或有一定局限性。

感染生猪及其产品的移动是导致疫情快速远距离传播的主要途径。尤其值得注意的是，ASFV 在未经高温处理的肉品中存活能力很强，未经高温处理的泔水、烟熏肉、风干肉、腌肉、火腿等也是造成病毒跨区域传播的重要因素。历史上，多起跨境传播的 ASF 疫情与航空器、列车运载上述猪肉制品的处理不当、感染ASF 野猪移动有关[10]。目前，应加强流行病学调查和主动监测排查工作，特别对病死猪的检测，应重点关注屠宰场、病死生猪无害化处理场等高风险场点，对已发现的确诊病例要做进一步追溯排查；加大科普宣传，发动养猪户、诊疗人员和相关从业人员主动上报可疑情况。若发生疫情，应严格按照《非洲猪瘟疫情应急预案》和《非洲猪瘟防治技术规范》进行处置。