莱芜猪ACLS4和H-FABP基因的多态性
及育种应用
随着生活水平的提高，人们对猪肉品质的要求也越来越高，肌内脂肪（Intramuscular fat content，IMF）是影响猪肉品质的重要指标之一，与猪肉的风味、嫩度、系水力等性状直接相关。IMF高的猪肉表现为大理石纹明显、肉有香味、易于咀嚼、口感好。由于长期对瘦肉率的选择，西方猪种的IMF降到1％左右，严重影响了肉的品质。我国地方品种猪的IMF较高，尤其以莱芜猪表现突出，肌内脂肪含量最高可达10.14％，是不可多得的宝贵的种质资源。尽管对莱芜猪高IMF的遗传机制开展了一些研究，然而控制莱芜猪高IMF及超级脂肪沉积能力的基因尚未确定。
酰基辅酶A合成酶长链4（Acly——CoA synthetase long chain family 4，ACSL4）基因属于酰基辅酶A合成酶长链基因家族，在体内催化合成脂酰CoA，是哺乳动物利用脂肪酸的第一步反应，在脂类代谢和脂肪酸分解中起着最基本的作用，与生长和脂肪酸的比例相关。脂肪酸含量是猪的重要肉质性状，研究表明，ACSL4基因可以作为影响猪肉质性状的候选基因。心脏型脂肪酸结合蛋白（Heartfatty acid——binding protein，H——FABP）基因编码一类低相对分子质量（约15000）的胞浆蛋白，主要作用是将脂肪酸从细胞膜运送到氧化和三酰甘油及磷脂合成的部位。H——FABP在细胞内与脂肪酸结合，使细胞内外保持一定的浓度差，促进细胞摄取脂肪酸。有研究表明，H——FABP基因是影响IMF含量的候选基因，H——FABP基因多态性与猪IMF含量存在显着相关。
为明确ACSL4和H——FABP基因的多态性是否与莱芜猪的IMF及超强脂肪沉积能力有关，本试验采用PCR——RFLP技术分别测定了ACSL4的SNPG2645A位点及H——FABP的HinfⅠ和MspⅠ位点在莱芜猪中的分布，并通过测序明确了莱芜猪各位点多态性形成的机制；在此基础上，提出了通过利用这2个多态性位点对莱芜猪进行选育的育种应用方案，预期将提高莱芜猪IMF性状的均一性和进一步促进莱芜猪种质的保护和利用。
1 材料与方法
1.1 试验动物
106头莱芜猪（63头母猪和12头公猪采于2012年7月8日；31头后备母猪采于2012年11月1日）来自山东省莱芜市莱芜猪原种猪场，剪取小块耳组织放在70％乙醇中，然后保存在——20℃冰箱中以备提取基因组。
1.2 主要试剂
血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN生化科技（北京）有限公司，Taq DNA聚合酶（DR001A）、限制性内切酶RsaⅠ（FD1124）、HinfⅠ（FD0804）和MspⅠ（FD0544）均购自宝生物（大连）有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.3 试验方法
1.3.1 基因组的提取
用血液／细胞／组织基因组DNA提取试剂盒提取耳组织基因组，采用0。8％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定基因组质量及浓度，——20℃低温冰箱保存于TE（pH 8。0）中备用。
1.3.2 引物设计和PCR扩增
根据猪ACSL4基因cDNA全序列（GenBank登录号DQ144454）对3′UTR区设计引物，根据猪H——FABP基因cDNA序列（GenBank登录号X98558）对5′上游区域第一外显子和第一内含子的部分区段设计引物，根据猪HFABP基因cDNA序列GenBank（登录号Y16180）对第二内含子区设计引物。引物序列见表1。
PCR反应总体系为25L，含10×ExTaqTM Buffer 2.5L，dNTPs2L，上、下游引物（10 mol／L）各0.5L，基因组DNA（50ng——100ng）1L，Ex——Taq0.2L，水补齐至25L。PCR 反应条件为94℃5min；94℃30s，56.5℃或59℃30s，72℃30s，32个循环；72℃延伸5min，PCR产物用1％——2％的TBE琼脂糖凝胶电泳检测。
1.3.3 多态性检测
采用PCR——RFLP方法。酶切体系为10L，包括PCR产物7L，内切酶2.5U，水补齐至10L。37℃2h。酶切产物用1％——2％的TBE琼脂糖凝胶电泳检测。根据酶切后片段长度的差异进行个体基因型的判定。
1.3.4 测序
分别挑选ACSL4的SNP G2645A位点和H——FABP的HinfⅠ位点各个基因型的个体进行PCR产物测序，PCR产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司，所用仪器为基因自动分析仪ABI3730。每种基因型至少测3个个体。
1.4 数据分析
用Popgen 32Version 1.32计算基因型频率、基因频率并进行卡方检验。当P＜0。05时认为差异显着。
2 结果
2.1 PCR扩增
PCR扩增后，分别用2％、1.5％和1％的琼脂糖凝胶电泳检测ACSL4、H——FABP（HinfⅠ）及H——FABP（MspⅠ）的扩增效果，在紫外灯下观察，可看到目的片段大小分别是181、683、795bp（图1），且无任何杂带，说明3对引物特异性好。
2.2 基因型和等位基因分析
在106头莱芜猪中，ACSL4的SNP G2645A位点共检测到两种基因型，AG（134、108bp）基因型和GG（108bp）基因型（图2），没有检测到AA基因型；其中，GG 基因型的频率为0.934，等位基因G的频率为0.967，为优势基因型和优势等位基因（表2）。对于H——FABP的HinfⅠ位点，在检测的99个个体中共检测到3种基因型，HH（339、173、112bp）基因型、Hh（339、229、173、112bp）基因型和hh（339、229、112bp）基因型（图2）。基因型HH和Hh的频率分别为0.323和0。485，而hh基因型的频率较低（0.192）。等位基因H和h的频率分别为0.566和0.434（表3）。对于H——FABP的MspⅠ位点，在106头莱芜猪中没有检测到多态，所有个体均为AA基因型，795bp的片段均被MspⅠ酶切成736bp和59bp2个片段，莱芜猪在该位点处于纯合状态。
2.3 多态性位点的测序验证
经测序分析发现，H——FABP的HinfⅠ位点的多态性在莱芜猪上是由于在H——FABP基因1324位点有1个T的插入、缺失多态造成的（图3）。而ACSL4的SNP G2645A位点在莱芜猪上是由于G＞A突变造成的（图4）。
2.4 Hardy——Weinberg平衡检验
经过卡方检验，在ACSL4的SNP G2645A位点和H——FABP的HinfⅠ位点及MspⅠ位点，所检测的莱芜猪群体均处于Hardy——Weinberg平衡状态（P＞0.05）（表2、表3）。
2.5 基因的多态信息含量
莱芜猪在ACSL4基因的SNPG2645A位点呈高度多态（PIC＞0.5），在HFABP的HinfⅠ位点呈中度多态（0.25＜PIC＜0.5）（表2、表3）。
2.6 多态性位点的育种应用
莱芜猪突出的特点之一是具有超强的脂肪沉积能力，它的IMF平均在10％左右；但是莱芜猪IMF的变异较大，限制了它在猪育种中的应用。在本试验检测的3个与猪IMF相关的位点中，H——FABP的MspⅠ位点已达到纯合，而在ACSL4的SNP G2645A位点和H——FABP的HinfⅠ位点，莱芜猪均未达到纯合，但都以与高IMF相关的等位基因的频率（分别为G等位基因和H 等位基因）较高。因此，在莱芜猪本品种选育中，可以顺序选择ACSL4 G2645A位点GG基因型纯合个体和H——FABP HinfⅠ位点HH 基因型纯合个体，提高莱芜猪IMF性状的均一性。
3 讨论
肌内脂肪含量（IMF）是影响猪肉质的重要性状之一。研究表明，ACSL4基因和H——FABP基因与该性状显着相关。ACSL4在脂质生物合成和脂肪酸代谢过程中均发挥重要作用，Ma等研究发现，ACSL4基因有两个SNP（内含子3：g.280G＞A和g.359A＞C）位点与眉山猪的背膘厚、日增重等显着相关。Rus′c′等用PCR——RFLP的方法检测了132头杜——大——长杂交猪ACSL4基因SNP G2 645A的多态性，证明该多态性位点与肌内脂肪等肉质参数显着相关，并且GG基因型猪的IMF含量最高。Corominas等用实时定量PCR的方法检测了120头伊比利亚——长白杂交猪ACSL4基因SNP G2645A在肝脏中的表达情况，发现等位基因G的表达量比等位基因A要高（P＜0.05）。王继文等研究发现，鹅ACSL4蛋白质与哺乳动物一样也存在两个保守功能区（ATP／AMP motif和FACS motif），且与肝脏脂质沉积相关指标呈显着正相关（P＜0.05），暗示其在鹅肝脂肪变性中可能扮演着重要的角色。本试验运用PCR——RFLP的方法检测了ACSL4基因SNP G2645A在106头莱芜猪中的多态性，结果只检测到AG基因型和GG基因型，没有检测到AA基因型。其中，GG基因型和等位基因G的频率占优势，与Rus′c′等、Corominas等的结果相符，说明ACSL4基因SNP G2645A的多态性与莱芜猪的IMF有关。
H——FABP基因是FABP家族成员之一，主要功能是参与细胞内脂肪酸的运输，猪H——FABP基因定位在6号染色体上，多位点连锁分析表明其标记次序为Sw316（——5.1）——H——FABP（11.5）——S0003，这一染色体区域被认为是影响脂肪性状的数量性状位点（QTL）的区域。Gerbens等对影响脂肪性状的单核苷酸多态位点进行了检测，结果发现多态位点1定位在5′上游区（由HinfⅠ限制性核酸内切酶所识别），多态位点2定位在第二内含子区（由MspⅠ和HaeⅢ限制性核酸内切酶所识别）。李长龙等研究发现H——FABP基因多态性与IMF有显着的相关性，但与背膘没有显着的相关性。Lee等检测了H——FABP基因HinfⅠ和MspⅠ两个位点在伯克郡猪中的多态性，发现这两个多态性位点与肌内脂肪等其他肉质参数显着相关，并且HH基因型和AA基因型猪的IMF比其他基因型的猪显着较高。本试验运用PCR——RFLP的方法检测了H——FABP基因HinfⅠ和MspⅠ两个位点在莱芜猪中的多态性，结果检测到HH、Hh和hh3种基因型，本试验发现莱芜猪HinfⅠ位点多态性是由于在H——FABP基因1324位点有1个T的插入、缺失多态造成的，H等位基因的频率较高；而Han等的研究均认为该位点是一个T／C多态。我们也对比了各10头莱芜猪和大白猪HH、Hh和hh3种基因型的序列，发现在该位点的多态性均是1324位点T的插入、缺失所造成的。我们认为猪在该位点T／C多态的成因可能是1324位点T的插入、缺失。
在H——FABP的MspⅠ位点方面，研究人员在106头莱芜猪中没有检测到多态性。Pang等的研究发现MspⅠ位点在内江猪、荣昌猪、汉江黑猪和八眉猪等中国地方猪种中没有多态性，但是在杜洛克、长白猪、大白猪以及野生型猪中存在多态性。这些结果表明，该位点在我国地方猪种可能没有多态性。
本试验在前人研究的基础上研究了ACSL4基因和H——FABP基因在莱芜猪群体中的多态性分布并提出了在莱芜猪本品种选育中的育种应用方案，对培育具有较高IMF的莱芜猪种质提供指导作用，预期将提高莱芜猪IMF性状的均一性和进一步促进莱芜猪种质的保护和利用。
注释：1.山东农业大学动物科技学院：姜伟，王力圆，李艳平，姜运良
2.莱芜市畜牧兽医技术推广中心：孙延晓，沈彦锋，张宏昌
