断乳猪多系统衰竭综合征研究进展

全艳平赵玉军沈阳农业大学畜牧兽医学院（110161） 近年来，加拿大。美国、英国、法国、日本等许多国家流行一种被称为断乳猪多系统衰竭综合征（postweaningmul-tisystemicwastingsydrome,pmws）的疾病，该病严重影响断乳猪生长发育，且致死率很高，因而引起各国的高度重视。各国对本病进行了深入的研究，本文从本病的病原学。流行病学、症状、病理变化、诊断等方面的国内外的研究进展进行综述。 １简要病史 １９９１年，加拿大西部一农场首先发现一种发生于断乳仔猪的以渐进性消瘦，体重减轻，呼吸道症状及黄疽，组织学病变有间质性肺炎，淋巴组织增生，肉芽肿性肝炎和肾炎为特征的疾病。 １９９５年，法国布列塔尼约１００个猪群中的８～１３周龄猪，发生一种以多系统衰竭为特征的传染病，表现肌肉衰弱无力，下痢，呼吸困难，表现症状后２～８天内出现部分死亡，约有５０％左右猪存活，存活猪生长发育不良。组织学检查发现，淋巴细胞坏死萎缩，多核巨细胞聚集。 １９９７年６月，日本toyama县一农场断乳猪表现生长不良，皮肤苍白，精神不振，腹泻等症状。组织病理学变化有：淋巴结病变，淋巴细胞减少，网状内皮细胞中检测出嗜碱性包涵体，电子显微镜下观察包涵体中有类圆环病毒颗粒，这些临床症状和病理变化与ｐｍｗs相似，对感染猪淋巴结ｐｃｒ产物dna测序，表明病毒与圆环病毒同源性大于９６．９％。 ２０００年，韩国报道了第一例pmws，特殊的病理变化是淋巴结、肝、脾发生广泛的肉芽肿性炎症，以上皮样巨噬细胞和多孩巨细胞浸润为特征，并在这些组织中成功地扩增530bp的圆环病毒dba片段。 ２病原学 ２.１主要特性 ｐｍｗ的主要病原是猪圆环病毒（porcinecircovirus,pcv）。pcv在分类上属于圆环病毒科，其共同特征为病毒无囊膜，由单股环状的ｄｎａ链组成。圆环病毒科包括鸡传染性贫血病毒（ｃａｖ），鹦鹉啄羽病病毒（ｐｂｆｄ）和ｐｃｖ三种动物病毒及地三叶草侏儒病毒（scsv），椰树叶腐烂病毒（ｃｆｄｖ），香蕉簇顶病毒（ｂｂｔｖ）等植物病毒。 猪圆环病毒直径１７nm，呈２０面体对称，病毒衣壳蛋白为１条多肽链，分子量为３６ｋd），ｄｎａ长为１．７６ｋｂ，病毒沉降系数为５２s，浮密度为１．３７ｇ／cm3。病毒对外界环境抵抗力较强，在酸性环境及氯仿中可以存活较长时间，在高温环境（７２℃）也能存活一段时间。据英国中央兽医研究所的数据表明，virkon s消毒剂在１：２５０稀释度时能有效杀灭圆环病毒。 １９７４年，德国学者tischer首先从猪肾传代细胞ｐｋ－１５中检出ｐｃｖ，该病毒可长期持续污染ｐｋ－１５细胞，但不表现ｃｐｅ（cytopathiceffect，细胞病变效应）。ｇｉｌｌｓ实验证明，传了９年的ｐｋ－１５细胞在其１４２代培养物中仍存在ｐｃｖ抗原，其污染来源还不清楚，但试验证明，培养用的血清和其它药物并未被pcv污染，ｐｃｖ可能源于原始猪细胞。ａｌｌａｎ（１９９４）报道了在猪和牛单核细胞／巨噬细胞培养中复制了ｐｃｖ。pcv在原代胎猪肾细胞。恒河猴细胞及ｂｈｋ－２细胞中不能生长。在接种ｐｃｖ的ｐｋ－１５培养细胞物中加入d-氨基葡萄糖，可促进pcv复制，使得感染pcv的细胞数量可提高３０％。 感染pcv的ｐｋ－１５培养细胞内含有许多胞浆内包涵体，少数感染细胞内含有核内包涵体。胞浆内包涵体大多数分布于细胞核周围，大小不等，圆形或卵圆形，均质。胞浆内包涵体可分为两种类型：一种形态较小，直径０．ｌ～0.5μm，无膜包围，呈颗粒状，与胞浆的界限不明显。一些包涵体中有直径１７士ｚｎｍ二十面体的病毒粒子，呈水紧密的聚合，偶尔形成类结晶状排列。这种小包涵体可能是病毒装配和成熟的场所。另一种包涵体形态较大，直径０．５～5.0μm，数量多，周围有膜包围，电子密度较大。这种大的包涵体是典型的自吞噬作用的结果。核内包涵体无膜包围，常与网状核仁或异染色质的凝集物有关，呈圆形，铃形或颗粒状，直径为０．ｌ～1.0μm。 ２．２病毒的分子生物学研究进展 ａｌｌａｎ（１９９８）发表报告，他们从加拿大、美国、法国、西班牙、丹麦、北爱尔兰存在ｐｍｗ症状猪群中，分离到了ｐｃｖ抗原，制备了pmws分离株的ｐｃｖ多克隆抗血清和单克隆抗体，还制备了多株传统的没有病原性的ｐｃｖ单克隆抗体。通过对pｃｖ核苷酸进行测序，发现从有pmws症状猪群体内分离的ｐｃｖ抗原性相似，但与传统的持续污染猪肾细胞的ｐｃｖ抗原性有很大区别。 morozov等（１９９８）报道了从衣阿华州有pmws症状的猪体内分离到ｐｃｖ，将此pmwspcv与ｐｋ－１５细胞污染的pcv基因序列进行比较，发现这两种不同来源的pcv基因序列存在很大的差异性，pcv全序列同源性为７６％。在两个主要的开放读码框（ｏｒｆ1和ｏｒｆ2）中，ｏｒｆｉ在两株ｐｃｖ间相对保守一些，核苷酸同源性为８３％，氨基酸同源性为８６％。orf2可变性相对较大，核苷酸同源性为６７％，氨基酸同源性为65％。用ｐｃｒ和原位杂交方法还可检出pmwspcv在各种感染组织中ｄｎａ丰度。结果还表明，pmwspcv可感染多种组织和巨噬细胞、淋巴细胞、内皮细胞。上皮细胞。 用感染pcv的ｐｋ－１５细胞接种猪，可以回收病毒，根据病毒抗原的出现及抗体的产生，表明猪感染了pcv，但没有发现临床症状和病变。说明来源于ｐｋ－１５细胞的pcv是非致病性的。各国对ｐｃｖ和pmws的一系列研究表明，pcv在猪体内长时期演变过程中，产生了有病原性的变异株，后来被称为pcv2(域ｐｍｗｓｐｃｖ，pcv－ｌｉｋｅ），相应 地将没有致病性的持续污染ｐｋ－１５细胞的这种毒株称为pcv1（或nppcv,pk-15pcv）。混合感染。 pcv2是pmws的主要病因，但不是唯一的病原。pmws症状的出现需pcv和其它因子共同作用。在对无菌猪接种ｐｃｖ实验时，没有发现pmws的临床症状，可能是接毒量小，扑杀时期过早或许是无菌猪饲养在无菌环境中，没有暴露出表现症状的重要的环境因子，利用pmws患猪的组织乳剂或细胞培养分离继代的病毒接种仔猪，出现pmws的特征病变。说明由于细菌、病毒的二重感染，常使pmws的症状复杂化，严重化。 krakowka（２０００）的实验表明，猪细小病毒（ｐｐｖ）在pmws中是一种重要的致病因子。对悉生菌猪鼻腔单独接种pcv1，pcv2，ｐｐｖ或混合接种pcv1/pcv2,pcv1/ppv,pcv2/ppv。利用免疫化学方法检测在研究pmws的疾病发展过程中病毒抗原的分布，病毒血症，鼻腔和眼的分泌物和粪便中病毒dna。所有接种单一致病因子的猪，和混合接种pcv1/pcv2,pcv1/ppv猪（除1头外），都未表现；临床症状，但表现一过性病毒血症。感染后３５天，显微镜下观察肝脏、心肌有炎性细胞浸润。一头接种pcv1/ｐｐｖ猪在接毒后２周出现ｐｐｖ病毒血症，淋巴管炎，肉芽肿性炎症。４头接种pcv2/ppv猪都发生pmws，表现出pmws特征性症状：沉郁，厌食，黄疽，粘膜下层水肿。一头猪在接种后２７天濒临死亡。其余三头接种后２７～３０天内因病重被捕杀，剖检可见淋巴结缩小，肝脏有斑点，除脑组织外，所有组织都存在广泛的血管肉芽肿，巨噬细胞和组织细胞中可见嗜碱性胞浆包涵体，ｐｃｖｚ抗原广泛分布于巨噬细胞内，ｐｐｖ抗原散在分布。在眼、鼻分泌物和粪便中检出了pcv2抗原。还可见肝细胞坏死，胆汁显著淤积。研究表明，pmws在悉生动物中需要ｐｃｖ2和其它感染因子，如ｐｐｖ，才能表现出完整的疾病症状。 ２．３病毒基因型 不同地区pcv2流行的基因型略有差异。pcv2基因型因地域不同又有许多小分支，从法国分离的ｐｃｖ2基因序列与其他地区分离的pcv2差别最大，形成一个独立的分支。从台湾分离的pcv2与加拿大的分离株略有差别，从美国分离的所有ｐｃｖ2同源性很高。我国对本病的报道很少，郎洪武等用ｅｌｉｓａ方法在河北、天津、北京等省市猪场均检测了pcv2抗体。曹胜波等用pcr(聚合酶链式反应）方法在河南、江西、湖北、广东等省检测到了pcv2，因此ｐｃｖ2在我国已广为流行。实验表明，我国猪群pcv2阳性率２１．４％～３３．３％，我国流行pcv毒株与欧洲毒株同源性高于美洲和台湾毒株，与法国分离的一个毒株（af20311）同源性最高。 ３流行病学 ３．ｌ致死率 pmws多发生于5～16周龄的猪，发病率３％～５０％。法国madec（２０００）报道，法国一农场发生pmws，１１～１３周龄受害最严重，从断乳到屠宰致死率达１１％。调查表明，pmws是～种慢性、进行性高致死率的疾病。英国养猪协会（theuknationaipigassociation）人员称，pmws已成为断乳仔猪致死率最高的一种疾病。为了控制ｈｃ（猪瘟）和fmd(蹄疫），英国屠杀了２５万头猪，另有３０万头因pmws死亡。一些农场主报道，其致死率超过４０％。 ３．２传播途径 猪对ｐｃｖ具有较强的易感性，可经口腔、呼吸道途径感染。aiian（１９９６）证实少数怀孕母猪感染pcv后，在妊娠早期（胎儿产生免疫能力前）可通过胎盘感染胎儿，导致胎儿持续感染和病毒及抗原的不同分布。用pcv经口感染试验猪后，其他未接种猪的同群感染率达１００％，感染猪可从鼻液和粪便中排出病毒。 ３．３pcv流行情况 pcv广泛存在于许多国家猪群中。血清学调查表明，德国。加拿大、英国、爱尔兰猪群中ｐｃｖ抗体阳性率分别达到８５％，５５％，８６％，９２％。由于ｐｃｖ污染细胞不产生细胞病变效应（ｃｐｅ），一直未被发觉，有实验表明pcv可能流行了许多年。magar(2000)报道，通过间接免疫荧光试验对１９８５年、１９８９年、１９９７年从加拿大一屠宰场采集的血清样品进行pcv1、pcv2抗体检测。每年都有ｐｃｖｉ、ｐｃｖ2阳性血样检出，且pcv2血清阳性数大于pcv1阳性数。ｐｃｖ2是加拿大猪群中主要pcv2流行株。gresham（２００１）报道，英格兰和威尔士猪群ｐｃｖ感染率达１８～２０％。但苏格兰未见报道。 ４临床症状及病理变化 临床表现以多系统进行性功能衰竭为特征。表现精神不振，食欲不佳，有的发热，被毛粗乱，生长发育不良，进行性消瘦；有的贫血，皮肤苍白，肌肉衰弱无力，还表现出咳嗽、喷嚏、呼吸困难等呼吸系统症状。体表淋巴结，特别是腹股沟淋巴结肿大，部分病例可见皮肤、可视粘膜黄疽，下痢及嗜睡。 最显著的病变是全身淋巴结，特别是腹股沟淋巴结，肠系膜淋巴结，气管、支气管淋巴结及下颌淋巴结肿大到２～５倍，有时可达１０倍。切面硬度增大，呈均匀的苍白色，集合淋巴小结也肿大。发生细菌感染，则淋巴结可见炎症和化脓病变，使病变复杂化。 肺肿胀，有散在、大而隆起橡皮状硬块，有黄褐色斑散布于肺表面。严重的病例，肺泡出血，部分病例尖叶和心叶萎缩或固质化。脾中度肿大，是肉变。半数病例肝脏无明显异常，其他病猪表现不同程度的虎班状外观，并伴有轻度或中度萎缩，有的病例肝肿大肾脏水肿，苍白，被膜下有白色坏死灶，盲肠和结肠粘膜充血或瘀血。据报道，有的病例发生肝、肺、肾肿大，有广泛的肉芽肿性炎症。 ５ 组织学变化 淋巴结的皮质及副皮质区显著扩张，有单枚巨噬细胞。组织细胞浸润，有时还散布着大量的多核巨细胞。淋巴细胞减少，淋巴结基质常增生或有嗜酸性细胞浸润。淋巴滤泡有由组织细胞、类上皮细胞、巨噬细胞、多核巨细胞、嗜酸性白细胞、淋巴细胞集聚形成的肉芽肿。 肺泡内有单核细胞、嗜中性白细胞、嗜酸性白细胞浸润，肺有多灶性肉芽肿或弥漫性间质性肺炎。部分病例支气管、血管周围发生淋巴细胞、组织细胞、多核巨细胞浸润。 肝脏最常见门静脉周围淋巴细胞、组织细胞浸润，窦状隙内单核炎性细胞聚集，肝细胞坏死。慢性死亡病例，由于黄疸而使肝小叶周围纤维化，肝细胞坏死、消失，单核细胞弥漫性浸润。 肾脏有多灶性间质性肾炎，主要在皮质部发生淋巴细胞。组织细胞浸润，少数病例有肾盂炎，急性渗出性肾小球肾炎。 心脏多有各种炎性细胞浸润，轻度或中度的多灶性心肌炎，胃肠肌层有不同程度的肌炎。 ６ 诊断 本病的临床症状和病理变化有一定特征性，具有一定的诊断价值。但猪圆环病毒易与其它病毒、细菌混合感染，确诊本病需实验室诊断。 ６．１ 电镜检查 支气管淋巴结提取物负染后见到类圆环病毒颗粒（１７nm），在支气管淋巴结的超薄切片中，见到包涵体，由直径约为２０nm的电子致密性颗粒组成，呈晶状排列。 ６．２ 间接免疫荧光试验(ｉｉｆ) ｉｉｆ是一种比较特异的血清学方法，将病料接种ｐｋ－１５细胞，用兔抗pcv高免血清与细胞培养物中的pcv反应，可对pcv进行检测和定型。试验时可用pcv1和ｐｃｖ2两种高免血清分别与pcv的细胞培养物反应，虽然这两种血清与pcv反应时会出现一些反应，但同型抗原与抗体反应时，血清的稀释效价要高于异 型反应。 ６．３ 原位杂交试验（ｉｓｈ） nawagitgul（２０００）研究制备了能区分ｐｃｖｉ和pcv2的探针。根据pcv2的ｏｒｆｉ和orf2的有义链和反义链合成核酸探针。在４２℃和５８℃，ｏｒｆｉ反义链探针与感染细胞中pcv1和ｐｃｖｚ，都杂交。在５８℃时，orf2反义链探针和pcv2核酸杂交，不与pcv－ｌ核酸杂交。ｏｒｆｉ和ｏｒｆｚ有义链探针只与pcv2核苷酸结合。反义链探针产生的信号比有义链强。研究结果表明，ｏｒｆｉ反义链探针适合检测两种类型的ｐｃｖ（ｐｃｖｉ和pcv2），orf2反义链探针可区分ｐｃｖｉ和pcv2。 ６．４ 竞争性酶联免疫吸附试验(c－ｅｌｉｓａ) walker（２００0）取道以分离的pcv－２细胞培养物作为抗原，以pcv2特异性单克隆抗体作为竞争性反应物，以间接免疫荧光试验作对照，ｃ－elisa的敏感性和特异性达到９９．５８％和９７．１４％，ｃ－ｅｌｉｓａ可用于大规模猪群的pcv快速诊断。 ６．５聚合酶链式反应(pcr) 根据pcvdna的核音酸序列，设计特异性引物进行ｐｃｒ反应，可直接检测组织病例及其细胞培养物中的病毒核酸，是一种快速简便特异的方法。ouardani等建立了一种简便的多重ｐｃｒ法，可对pcv进行检测和定型。该方法设计了２套引物，是根据pcvdna的２个开放读码框的核昔酸序列设计的。第１套引物有２对引物，其中１对引物扩增orf2上４８８bp，可检测pcv1和pcv2，另１对引物只扩增pcv1的ｏｒｆ2上的３７５bp；第２套引物也有２对引物，其中１对弓！物扩增orf1的６４６bp，可检测pcv1和ｐｃｖ2，另１对弓ｉ物只扩增pcv1的orf2上的４２５bp。这２套引物都可以对ｐｃｖ进行检测和定型。 ７ 防治措施 本病没有有效的治疗方法，抗生素对pmws患猪无效。但抗生素的使用和良好的饲养管理，有助于控制二重感染。目前还没有疫苗可供应用。主要采取的对策是：加强饲养管理，降低饲养密度，实行严格的全进全出制，减少环境应激因素，如温度变化、贼风和有害气体。实施严格创生物安全措施，防止ｐｃｖ和其他感染因子的混合感染。用早期发现疑似猪进行检查、淘汰。避免从疫区引进猪只，严格控制来访者、车辆、货物进入猪场。 ｐｍｗｓ严重影响猪的生长发育，但对其发病机理、传组源等问题还不完全清楚，许多问题急待解决。我国是一个养猪大国，且pmws已在我国广为流行，应引起我国兽医工作者的高度重视，及早开展pmws的研究和调查。