复合益生菌发酵固体饲料条件研究
张翠绵，贾楠，胡栋，王占武
河北省农林科学院遗传生理研究所，河北省植物转基因中心
利用有益微生物发酵饲料，不仅能改善饲料的适口性，提高饲料消化吸收率，促进畜禽的健康生长，而且能预防肠道疾病的发生，减少抗生素的使用，为人们提供健康安全的动物产品。将含有较多纤维素的农作物秸秆转化为高效能的生物饲料，代替部分粮食饲料，可降低养殖成本，缩短饲养周期，减少环境污染，具有广阔的应用前景。目前，应用较多的发酵微生物主要有乳酸菌和酵母菌，两类菌具有一定的协同作用，发酵过程可代谢产生多种消化酶及生理活性物质，适口性好，饲喂效果显著。但由于菌种发酵特性的差别，发酵条件对不同菌种的生长繁殖和发酵饲料的品质会产生较大影响，而采用从猪肠道分离获得的生理性益生菌－嗜酸乳杆菌为发酵微生物，再配合其他微生物的研究还鲜有报道。为提高发酵效果，本研究选用面包酵母菌、植物乳杆菌与嗜酸乳杆菌配合组成复合发酵菌系，着重研究了菌种配比，以及发酵温度、接种量、物料水分和pH值等对以玉米秸秆粉为主固体饲料的发酵效果，最后进行了育肥猪饲喂试验。研究结果旨在为发酵饲料的规模生产提供技术支持。
1 材料和方法
1.1 发酵菌种
面包酵母、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌（菌种均由河北省植物转基因中心保存提供。
1.2 培养基
1.2.1 发酵培养基
麦芽汁培养基：麦芽汁70mL，用于培养酵母菌菌种。
改良MＲS液体培养基：牛肉膏10g、蛋白胨10g、酵母膏5g、柠檬酸铵2g、葡萄糖20g、吐温-801mL、K2HPO42g、MgSO4·7H2O0.2g、MnSO4·4H2O0.2g、水1000mL，用于乳酸菌培养。以上培养基均在121℃下灭菌15min。
1.2.2 固体饲料发酵基质
采用的原料和比例为：玉米秸秆粉50%、红薯秧粉35%、麸皮10%、玉米面5%。
1.2.3 菌体生长参数的测定
根据酵母菌和乳酸菌的生长特点，进行菌种比例、接种量、发酵温度、物料初始pH值、发酵周期等对固体饲料发酵效果的影响。检测指标为物料pH值，活菌数量等。发酵结束后采用平板稀释计数法，分别用YPD和MＲS固体培养基检测酵母菌和乳酸菌数量。
1.2.4 数据处理
试验数据用Excel2003和SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析和相关性分析，结果以平均值±标准差表示。
1.3 方法
1.3.1 菌种的制备
接种活化的斜面菌种于种子培养基上，酵母菌于30℃好氧培养48h，嗜酸乳杆菌于37℃厌氧培养24h，植物乳杆菌于37℃摇瓶培养24h，制备发酵种液。
1.3.2 环境温度对发酵效果的影响
发酵前调物料的pH值为7.0左右，使面包酵母∶嗜酸乳杆菌∶植物乳杆菌=1∶1∶1，混匀后，按3%接种量接入物料中，物料含水量为50%，搅拌均匀后装入不透气的塑料袋中，压实，封口，分别置于20、25、30、35℃的环境中培养3d；每处理3次重复。检测指标为3种微生物的活菌数量和物料pH值，下同。
1.3.3 菌种比例对发酵效果的影响
分别按面包酵母∶嗜酸乳杆菌∶植物乳杆菌为1∶1∶1，1∶0.5∶0.5，1∶0.35∶0.35，1∶0.25∶0.25的菌量比例，制作发酵菌剂，进行发酵试验。接种量3%，物料含水量50%，pH值7.0。物料搅拌均匀后装入不透气的塑料袋中，压实，封口，置于1.3.2确定的最佳环境温度下培养3d；每处理3次重复。
1.3.4 接种量对发酵效果的影响
根据以上确定的菌种比例制作发酵菌剂，分别进行1%、2%、3%、4%、5%接种量对发酵效果的影响。其他发酵条件同1.3.3。
1.3.5 初始pH值对发酵效果的影响
分别调物料的初始pH值5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、，8.0，其他发酵条件按1.3.3进行。
1.3.6 发酵周期对发酵效果的影响
在上述试验确定的最佳发酵条件下，分别进行24、36、48、60、72、84、96、108h的发酵周期试验，比较发酵效果。
1.3.7 物料初始含水量对发酵效果的影响
分别对物料初始含水量40%、50%、60%、70%进行比较试验，发酵培养3d。
1.3.8 饲喂试验
在河北进考养猪场，选择长白育肥猪进行饲喂试验。发酵饲料替代15%日粮，饲喂时间30d。观察记录饲料的适口性、试验猪的精神状态、毛色和增重情况。
2 结果与分析
2.1 菌种的制备
分别培养制得面包酵母、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌菌液，菌体浓度分别为8.5×108cfu/mL、1.3×109cfu/mL、9.0×109cfu/mL。
2.2 环境温度对发酵效果的影响
适宜的环境温度可以加快物料的启动，缩短发酵时间。由表1可见，随着环境温度的升高，目的菌的活菌数逐渐增多，pH值下降，当环境温度高于30℃时，目的总菌数略有减少（P＜0.01），因此确定最适温度为30℃。
2.3 菌种比例对发酵效果的影响
由表2可见，3种菌的接种比例对最终的活菌数量有一定影响，当酵母菌和嗜酸乳杆菌与植物乳杆菌的接菌比例（体积比）为1∶0.35∶0.35时，最终发酵料中3种菌的总量都最高（P＜0.01），因此确定3种菌的最佳接种比例为1∶0.35∶0.35。
2.4 接种量对发酵效果的影响
由表3可见，随着接种量的增加，各目的菌活菌数量逐渐增加，当接种量为4%时，都达到最高值，3%、4%处理间总菌数及pH值的差别不显著（P＞0.05），从节约成本考虑，确定3种菌的混合接种量以3%为宜。
2.5 初始pH值对发酵效果的影响
由表4可见，当发酵料初始pH值5～7时，3种菌的活菌数随着pH 值的增大而增多。而当pH值8时，菌体生长受到影响，总菌数差异显著（P＜0.01）而pH值升高，因此，确定最佳起始pH值7.0。
2.6 发酵周期对发酵效果的影响
由表5可见，酵母菌和乳酸菌分别在36h、72h达到最大值，可能由于在开始阶段固体物料中含有大量的氧气，酵母菌大量繁殖，抑制了乳酸杆菌的生长，当物料中氧气被消耗掉造成了厌氧环境，适于乳酸杆菌的增殖，至72h时各目的菌活菌总数达到最大值，72h、84h间无显著性差异（P＜0.01）。随着培养时间的延长，总菌数量则有减少的趋势，并且从减少能耗考虑，发酵时间以72h为宜。
2.7 物料初始含水量对发酵效果的影响
由表6可见，当物料水分含量超过50%时，活菌数量降低，50%、60%间呈显著性差异（P＜0.01）；而pH值升高，处理间差异不显著（P＞0.05），可能原因发酵开始时，由于水分过多，透气性差，抑制了酵母菌的繁殖，发酵后期，乳酸菌大量繁殖消耗物料营养。确定发酵物料初始含水量以50%为宜。
2.8 固体饲料发酵效果
以玉米秸秆粉50%、红薯秧粉35%、麸皮10%和玉米面5%的比例制备发酵基质，从市场上选择一种类似发酵菌剂（处理2）和本试验菌剂（处理1）进行了发酵比较试验。处理3为不接种的空白对照。由表7～表9可见，在30℃环境条件下，处理1物料的pH值从开始的7.0迅速下降到4.3以下，之后pH值下降缓慢，最后稳定在pH值4.0以下，与处理2和处理3比较差异显著（P＜0.05），此时产品的酸香味浓郁，色泽金黄，纤维软化。处理2及处理3的pH值下降缓慢，发酵周期长，个别有霉变现象。
2.9 固体发酵饲料饲喂试验
选择生长一致，体重约30kg左右的长白猪，随机分组，每组5头，每组2次重复。试验组日粮中添加本研究获得的固体发酵饲料，添加量占日粮总质量的15%；对照组不添加固体发酵饲料，饲喂方法与管理条件相同。每天记录饲料消耗量和猪的生长情况，饲喂周期30d时空腹称重。
试验表明，试验组与对照组的料肉比差异不显著（P＞0.05），说明用固体发酵饲料代替一定比例的饲料粮是可行的，与全价粮食料喂效果相当，可达到同样的饲养效果，经计算，添加发酵饲料，每增重1kg可降低饲料成本0.80元。此外，试验猪毛色更加光亮，粪便细腻，精神状态好。
3 结论与讨论
经试验，确定了以面包酵母、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌固体饲料的最佳发酵条件：3种菌种的混合比例为1∶0.35∶0.35，物料的初始pH值7.0、含水量为50%、接种量3%、发酵温度30℃，发酵周期72h。在最佳条件下，各菌种都能正常繁殖，总菌量可达到2.17×109cfu/g。采用该工艺生产的菌种接种固体饲料，发酵结束后酵母菌及产酸菌大量增加，与市售菌剂发酵的饲料相比，pH值下降较快，物料色泽光亮，酸香味更浓郁，没有霉变现象。
试验表明，本研究选择的3种菌具有一定的协同作用，彼此间无拮抗，且功能互补，是获得良好发酵效果的重要保障。酵母菌为兼性厌氧菌，在发酵初始阶段优先生长繁殖，随着物料中氧气的消耗，为乳酸菌的生长繁殖奠定了基础，随着乳酸菌的增殖，物料pH值下降，并产生乳酸菌素等抑真菌物质，从而抑制了霉菌等杂菌的生长，随着发酵时间的延长，逐渐积累产生醇、醛等芳香物质以及各种活性酶等，显著提高饲料的适口性，促进饲料的消化吸收，这也是发酵饲料能代替部分饲料粮的主要原因之一。另外，动物摄入大量乳酸菌、乳酸等有益物质，可抑制肠道腐败菌的生长繁殖，从而减少氨、胺类物质的产生，间接提高饲料中粗蛋白的利用水平。总之，利用动物益生菌发酵高纤维质饲料，在代替部分饲料粮、降低饲喂成本的基础上，还可减少病害的发生和抗生素的使用，提高畜产品质量，具有广阔应用前景。
