贵州省某规模化猪场暴发猪瘟与链球菌病混合感染的诊断

供稿:刘刘刘

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    贵州省某规模化猪场暴发猪瘟与链球菌病混合感染的诊断

      刘建1,李春燕1,汤德元1,罗险峰2,曾智勇1,甘振磊1,郝飞1

      1贵州大学动物科学学院;2贵州省动物疫病预防控制中心



      猪瘟(classic swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的—种急性、热性和高度接触传染的病毒性传染病。该病的临床特征为发病猪高热稽留、细小血管壁变性导致引起各器官组织的广泛出血、脾脏梗死等(殷震等,1997;蔡宝祥,2010)。CSF具有高度接触传染性,流行广泛,发病率、死亡率极高,危害极大,给全球养猪业造成巨大的经济损失(Edwards等,2000)。中国将CSF列为一类动物传染病。猪链球菌病(streptococcicosis suume)是由链球菌引起的一种人畜共患的急性、热性、败血性传染病(陆承平,2001)。该病可以侵害各年龄段的猪,在断奶及混群时出现发病高峰,以败血症、肺炎、脑膜炎、淋巴结炎、多发性关节炎、多发性浆膜炎和新生仔猪死亡为主要特征(何孔旺等,2000;Martinez等,2003)。猪链球菌的流行无明显季节性,但在夏秋潮湿闷热季节和天气突变时期易发生,其发病率和死亡率很高,给中国养猪业造成了巨大的经济损失(崔焕忠等,2007;沈艳等,2007)。

      2012年6月,贵州省某猪场断奶仔猪150头,发病3d,共计死亡20头。为了掌握该猪场疫病的感染状况,本试验对该猪场送检的发病仔猪病料进行流行病学调查、临床症状观察、解剖病理诊断、细菌学检测和RT-PCR技术诊断,确诊该病为猪瘟和链球菌混合感染。现将诊断结果报告如下。

    1材料与方法

      1.1材料

      病料:贵州省某规模化猪场送检的2头发病断奶仔猪,同龄发病断奶仔猪血清20份。试验动物:20g~35g小白鼠购自贵阳医学院。

      1.2仪器及试剂

      显微镜购自日本Olympus公司;鲜血琼脂培养基、普通肉汤培养基购自上海阳光生物技术有限公司;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)购自北京索莱宝科技有限公司;无菌绵羊血购自上海锐聪试验室设备有限公司;Mueller Hinton(MH)琼脂培养基购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;革兰氏染液购自上海科兴生物科技有限公司;猪瘟抗体金标检测卡购自深圳市康百得生物科技有限公司;链球菌由贵州省动物疫病研究室鉴定并保存;其他培养基、微量生化鉴定管和药敏纸片均购自杭州微生物试剂有限公司;猪瘟病毒RT-PCR检测试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司;DL2000DNA Marker购自大连宝生物工程有限公司;琼脂糖购自Biowest公司。

      1.3检测方法

      1.3.1流行病学调查

      采用询问法了解猪场发病状况,记录结果。

      1.3.2临床症状及病理剖检变化

      对该猪场送检的2头发病猪进行临床症状及病理剖检变化观察,并记录试验结果。观察2头发病猪临床症状后,全部处死,解剖观察病理变化,此时应注意无菌操作。用灼烧过的手术刀(无菌操作)切开胸腔和腹腔,首先吸取积液或以棉签拭取胸膜及腹膜黏附物,然后再取内脏,如淋巴结、肾脏、脾脏、肺脏和肝脏等。

      1.3.3快速金标检测卡检测血清样本

      应用猪瘟病毒抗体快速金标检测卡对送检的20份血清进行检测,严格按照检测试剂盒说明书进行操作。

      1.3.4细菌分离培养

      无菌采集病变明显的肾脏、肺脏、淋巴结等组织器官及心包、胸腔、关节积液和心血接种在鲜血琼脂培养基上,置于5%CO237℃恒温培养箱中培养24h~48h,观察其形态特征,然后挑取单个细菌进行纯培养。同时对细菌进行涂片,革兰氏染色后置于光学显微镜下观察。

      1.3.5培养特性和菌落形态观察

      挑取上述纯培养的菌落分别接种于普通琼脂培养基、鲜血琼脂培养基及普通肉汤培养基中,37℃恒温培养箱中培养24h,观察不同培养基中被检细菌的生长状态和菌落特征。

      1.3.6生化特性鉴定

      取分离菌株的纯培养物分别接种于添加有0.07%NAD的微量生化鉴定管中,置于5%CO237℃恒温培养箱中培养24h~48h,观察结果。

      1.3.7药敏试验

      按标准纸片琼脂扩散法(K-B法)操作。用接种环挑取1~2环纯培养的分离菌,接种于含5%脱纤绵羊血的MH琼脂培养基上,涂匀,选取12种常用药敏纸片均匀地贴到培养基上,置于含有5%CO237℃恒温培养箱中培养24h~48h,观察结果,测定抑菌圈直径。

      1.3.8动物致病性试验

      将分离菌经24h的鲜血琼脂基础培养基纯培养物,用生理盐水稀释制成细菌悬液(CFU为5×108/mL),按0.5mL/只的剂量给小白鼠腹腔注射,接种5只;同时对对照组的5只小白鼠腹腔注射等剂量生理盐水。接种后观察小白鼠发病及死亡情况,剖检小白鼠,无菌取其心脏、肝脏和脾脏等组织作细菌分离鉴定。

      1.3.9RT-PCR检测

      按照猪瘟病毒RT-PCR检测试剂盒说明书处理上述收集的淋巴结、肾脏、脾脏、肺脏和肝脏等病料,然后提取病毒总RNA,进行RT-PCR扩增。RT-PCR反应体系20μL:16.8μLRT-PCR反应液(用前混匀),1.2μL酶混合液,2μL模板RNA。RT-PCR反应条件:42℃孵育45min;95℃预变性3min;95℃变性30S,60℃退火30S,72℃延伸25S,35个循环;72℃延伸10min。经琼脂糖凝胶电泳后得到检测结果。

    2结果与分析

      2.1发病情况

      该猪场断奶仔猪未免疫猪瘟疫苗,发病突然,3d内共计有50头断奶仔猪发病,其中死亡20头。病猪体表发红,耳下、四肢末端、股内侧有紫红色或蓝紫色出血点,发热,体温升高到40.0℃~41.0℃,稽留不退,食欲减退或废绝,衰弱颤抖精神沉郁,呆立不动或伏卧不起,少数病猪后期呼吸困难,口鼻流白色或血色泡沫。发病后猪场曾使用青霉素、链霉素等抗生素进行治疗,病猪体温有所降低,但发病后2d~3d死亡。

      2.2临床症状及剖检病理变化检测

      临床症状:送检病猪被毛粗乱,消瘦,尾根和肛门附近被粪便污染,眼角有脓性分泌物,精神沉郁,体温升高(41℃左右),咳嗽、呕吐、流涎、眼睑水肿,全身皮肤有明显出血点、出血斑;颈部皮下水肿。剖检病理变化:心包液增多,心肌柔软,色淡如煮肉样,心冠状沟,心内膜都有出血斑点;肺脏充血、出血;脾脏明显肿大、梗死,边缘或尖端有出血性梗死灶;肝脏边缘钝厚、质硬、切面结构模糊;黏膜充血,内积有腥臭黄白色内容物;膀胱黏膜有出血斑点或弥漫性出血;全身淋巴结肿大,呈蓝紫色或暗红色,切面为红白相间的大理石状外观;关节腔积液增多且混浊;脑膜下水肿、充血和出血。

      2.3快速金标检测卡检测血清样本

      应用猪瘟抗体快速金标检测卡对送检的20份同龄病猪血清进行检测。结果20份送检血清在检测线区(T)及对照线区(C)同时出现了紫红色线(图1),且检测线区(T)颜色较深,这表明猪体内的猪瘟抗体滴度很高。由于该猪场断奶仔猪并未接种猪瘟病毒疫苗,这表明该猪场很有可能存在野毒感染。

    图1  猪瘟抗体快速金标检测卡检测结果



      2.4细菌分离培养

      无菌采集病料接种在鲜血琼脂培养基上,置于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养24h~48h后,可见培养基上的细菌菌落长出灰白色、圆形、表面光滑、湿润边缘整齐半透明的小菌落,菌落周围形成β溶血环。取纯培养36h的菌落涂片革兰氏染色,光学显微镜下可见单个、成对或3个~5个短链排列的革兰氏阳性球菌(图2)。对剖检的2头病猪进行细菌分离,结果2例都分离出疑似猪链球菌,分出率为100%。

      2.5培养特性和菌落形态观察

      该分离菌在普通营养琼脂平板上,生长不良;接种在鲜血琼脂平板上,菌落小的呈无色透明,大的略呈淡灰色,菌落出现明显透明的β溶血环;普通肉汤培养基中培养24h呈均匀浑浊,管底有少量絮状沉淀,无菌膜或菌环形成,继续培养1d后,菌体下沉,肉汤变清朗。

      图2猪链球菌染色后观察结果(1000×)



      2.6生化特性鉴定

      将细菌纯培养物接种于微量生化鉴定管中,置于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养24h~48h后,结果见表1。由表1可知,鉴定结果符合猪链球菌的生化特性(东秀珠等,2001)。



      2.7药敏试验

      药敏试验结果见表2。由表2可知,根据NCCLS(2010)的标准判定其耐药性,结果表明,从该猪场分离的病原菌对先锋霉素、氯霉素、环丙沙星和阿莫西林高敏,对氧氟沙星、新霉素和卡那霉素中敏,而对氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素、强力霉素和红霉素已产生了耐药性。



      2.8动物致病性试验

      接种了分离菌的小白鼠均在24h~48h内死亡,对照组没有死亡。无菌取死亡小白鼠的心脏、肝脏、淋巴结和脾脏等组织接种在鲜血琼脂培养基上,结果分离出纯的经鉴定与以上一致的猪链球菌。

      2.9RT-PCL检测

      对送检的2份病料每份分别进行处理后,按照猪瘟RT-PCR检测试剂盒说明书提取病毒总RNA后,进行RT-PCR扩增。结果2份病料均出现了CSFV阳性条带,大小均为272bP(图3),测序后与预期结果相符,这说明送检的2份病料中都存在CSFV,且阳性率为100%。

    图3病料RT-PCR扩增产物电泳结果



    3讨论

      通过流行病学调查、临床症状观察、剖检病理诊断及猪瘟抗体快速金标检测卡检测,初步诊断该猪场断奶仔猪疑似猪瘟病毒和细菌混合感染。取发病猪的淋巴结、肾脏、脾脏、肺脏和肝脏等组织,通过进行细菌分离培养、生化特性、培养特性及动物致病性试验鉴定确诊该细菌为链球菌。RT-PCR结果显示,送检病猪中检出了CSFV核酸阳性条带,测序后与预期结果相符,均为CSFV,且该猪场断奶仔猪并没有接种猪瘟病毒疫苗,表明该猪场已经感染了CSFV野毒。综合分析以上结果,建议该规模化猪场紧急接种猪瘟病毒疫苗,加强饲养管理并合理投喂抗生素避免继发感染,同时将可疑猪和病猪全部隔离饲养,病死猪及污染物则彻底焚烧或深埋,对污染的圈舍和四周环境进行严格消毒,患病猪群则带猪消毒,对新购进猪要进行严格的隔离、检疫,隔离期间定期进行血清学抗体检测。

      药敏试验结果表明,该猪场感染的链球菌对氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素、强力霉素和红霉素已经产生了较高的耐药性,这可能是由于该猪场用药不规范,疗程不当,长期使用同一类药物或长期在饲料、饮水中加入预防性药物导致,这应引起足够重视;对氧氟沙星、新霉素和卡那霉素中敏;而对先锋霉素、氯霉素、环丙沙星和阿莫西林高敏,这可能是因为先锋霉素、环丙沙星和阿莫西林在该猪场并未广泛使用,而氯霉素近些年在临床上被禁用的结果,因此该猪场在治疗时可把先锋霉素、环丙沙星和阿莫西林作为治疗猪链球菌病的首选药物。对于混合或多重感染的情况,应当根据试验室检测和药敏试验结果,对症下药,避免乱用药而造成的死亡。

    (审核编辑: 猪猪侠)

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